Цитогенетическое исследование хориона при неразвивающейся беременности

Проблема невынашивания беременности продолжает оставаться актуальной и социально значимой в перинатальной медицине. Среди различных форм невынашивания беременности особое место занимает несостоявшийся аборт (неразвивающаяся беременность) – гибель эмбриона (плода) на раннем сроке гестации с длительной задержкой в полости матки. В структуре репродуктивных потерь частота неразвивающейся беременности составляет 10-20%; ее причины многочисленны и нередко выступают в комплексе [1, 2]. Этиология ранней эмбриональной гибели находится в зависимости от ряда генетических факторов эмбриона: нарушения эпигенетической регуляции, «скрытого» мозаицизма, однородительской дисомии, мутаций тандемных повторов ДНК и др. [3-9].

Особую роль в этиологии невынашивания беременности играет хромосомный дисбаланс у плода. Его роль велика на ранних этапах, после чего показатели резко снижаются. Так, аномальный кариотип в сроке гестации 6-7 нед имеют 60-75% эмбрионов, в 12-17 нед – 15-20%, а в 18-28 нед – только 2-7% [1, 2, 10]. Стандартное кариотипирование позволяет выявить все численные и крупные структурные аномалии хромосомного набора плода.

При рассмотрении этиологии случаев неразвивающейся беременности принято считать, что около половины эмбрионов I триместра беременности погибают преимущественно вследствие естественного отбора зачатий с генетическими аномалиями. Причиной гибели другой половины эмбрионов становится конечный результат аддитивного действия комплекса факторов со стороны как зародыша, так и матери, нередко выступающих в сочетании с неблагоприятными условиями внешней среды [2]. Это создает определенные трудности для дифференциальной диагностики причин гибели плода при неразвивающейся беременности.

Наиболее значимыми процессами I триместра беременности являются имплантация плодного яйца и формирование маточно-плацентарной области эндометрия. Они сопровождаются образованием ворсин хориона и их инвазией в децидуальные сосуды. Формирование плодовых сосудов плаценты происходит в процессе дифференцировки ангиобластов у 10-дневного зародыша, и отклонения в формировании сосудистой сети являются ведущим компонентом в патогенезе основных акушерских осложнений, таких как невынашивание беременности, плацентарная недостаточность, синдром задержки роста плода, эклампсия [11, 12]. Признаки указанных нарушений подлежат диагностике в ходе стандартизованных морфологических исследований биологического материала от прервавшейся беременности.

Выделяя два основополагающих фактора, обеспечивающих жизнеспособность плода, – нормальный кариотип и адекватное фетоплацентарное кровообращение, следует отметить, что, по данным литературы [2], для всех анеуплоидий характерны нарушения ангиогенеза различной степени выраженности и наличие гипопластических процессов в трофобласте. В работах последних лет [1, 13] доказана зависимость между васкуляризацией плаценты, уровнем экспрессии ангиогенных факторов роста и частотой самопроизвольных выкидышей.

Дисбаланс сосудистых факторов и нарушения генетической программы развития плода отражает глубина патоморфологических изменений, наблюдаемых в децидуальной ткани маточно-плацентарной области и в ворсинах незрелой плаценты (хорионе), в случаях неразвивающейся беременности, при их гистологическом исследовании.

Цель настоящего исследования – комплексный анализ результатов морфологического и цитогенетического исследований продуктов зачатия неразвивающейся беременности для определения этиологии гибели плода.

Стандартными цитогенетическим и морфологическим методами исследовано 116 образцов биологического материала, полученного в ходе инструментального удаления продуктов зачатия неразвивающейся беременности. Непосредственно в предоперационном блоке осуществлялся отбор биоптата для цитогенетического исследования, и в течение 30 мин в 10% растворе нейтрального формалина биопсийный материал доставлялся для морфологического исследования. Клинический диагноз неразвивающейся беременности был поставлен в ходе динамического ультразвукового обследования беременных в возрасте 21-44 лет (32,5±5,6 года). Гестационный возраст эмбрионов и плодов соответствовал 4-11,5 нед (7,5±1,8 нед). Биологический материал для исследования был получен в гинекологическом отделении ФГБУ «НИИ охраны материнства и младенчества» Минздрава РФ Екатеринбурга.

На биологическом материале продуктов зачатия было выполнено стандартное цитогенетическое исследование, позволяющее выявлять числовые и структурные аномалии хромосом. Для цитогенетического исследования ворсины хориона обрабатывали по стандартизованному протоколу ускоренного «прямого» метода приготовления препаратов, которые затем окрашивали унифицированным дифференциальным методом G-окраски с применением 0,25% раствора трипсина и раствора красителя Гимза [2]. Кариотипирование проводили на микроскопе Leica DM4000B c программным обеспечением Leica CW 4000 Karyo.

Для морфологического исследования был взят соскоб полости матки, содержащий эндометрий, ворсины хориона, вневорсинчатый цитотрофобласт.

После отмывки и сортировки биологический материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина в течение суток, затем проводилась стандартная гистологическая проводка. После заливки в парафин готовили срезы толщиной 5-6 мкм, окрашивали их гематоксилином и эозином и заключали в бальзам. Микроскопическое исследование проводили на микроскопе Carl Zeiss Primo Star.

При гистологическом исследовании биологического материала неразвивающейся беременности прицельно проводили анализ двух компонентов: децидуальной ткани маточно-плацентарной области и ворсин незрелой плаценты (хориона). Для описания данных морфологического исследования биологического материала была разработана и применена схема анализа морфологических признаков, характеризующих состояние эндометрия и ворсин ранней плаценты с учетом степени выраженности наиболее информативных из них. Морфологические критерии диагностики эндометриальной и плацентарной недостаточности при неразвивающейся беременности позволили проанализировать степень развития сосудов ворсин хориона, инвазии трофобласта и гравидарной трансформации децидуальной ткани [14].

Статистический анализ данных осуществлялся с помощью пакета прикладных программ Statistica 7.0. Различия между параметрическими переменными с нормальным распределением устанавливались при помощи t-критерия Стьюдента. Различия между непараметрическими переменными проводились при помощи &khgr;2 Пирсона. Нулевая гипотеза отвергалась при р≤0,05.

В результате цитогенетического исследования 116 образцов биологического материала продуктов зачатия неразвивающейся беременности в 54 (46%) случаях выявлен нормальный кариотип и в 62 (54%) – аномальный кариотип плодов (табл. 1).

Наши данные не противоречат приведенной в литературе частоте хромосомных аномалий у эмбрионов при неразвивающейся беременности, составляющей в случаях до 10 нед гестации 65-70% [2, 3, 6, 9, 15-17].

Как следует из табл. 1, наиболее распространенной аномалией кариотипа эмбрионов были трисомии – 41 (66%) случай. Среди трисомий самой распространенной была трисомия хромосомы 16 (10%). Следующими по частоте встречаемости были трисомии хромосом: 22, 21, 13 и половых (по 8%). Выявлено по 2 случая редких трисомий хромосом 1 и 19. В одном случае обнаружен сложный вариант двойной трисомии с участием дополнительных хромосомы Х и 22 (48,ХХY,+22). По данным литературы [16], частота двойной трисомии при неразвивающейся беременности варьирует от 0,21 до 2,8%.

По данным литературы, случаи моносомии аутосом крайне редки и чаще встречается моносомия хромосомы X, в нашем исследовании в 13% случаев. По данным исследований других авторов [2, 16, 17], частота моносомии Х составляет около 10%.

В 2 (3%) случаях обнаружены структурные перестройки хромосом: делеция длинного плеча хромосомы 16 [46,ХX,del(16)(q12)] и нереципрокная транслокация хромосом 3 и 5 [46,XY,t(3;5)(q25;q35)]. Частота не отличалась от данных других авторов [2, 9, 16, 17] – 3,8-6%.

Полиплоидия была представлена только в варианте триплоидии с частотой 16%, которая согласуется с данными литературы [7, 9, 15-17] по другим популяциям. Известно, что триплоидия является результатом либо нарушения созревания половых клеток (отсутствие редукции диплоидного набора), либо оплодотворения одной яйцеклетки двумя сперматозоидами [2, 9]. В нашем исследовании один из случаев триплоидии представлял собой химерный вариант кариотипа (chi69,ХХY/46,ХY).

Интересной особенностью полученных результатов является высокая частота мозаичных форм хромосомных нарушений, которые составили 19% (12 случаев) от числа аномальных кариотипов. В настоящее время одной из причин хромосомного мозаицизма на ранних этапах онтогенеза человека рассматриваются нарушения эпигенетической регуляции экспрессии генов, выполняющих различные функции в ходе клеточного цикла [9]. По данным исследований [7], проведенных с использованием стандартного цитогенетического анализа, частота мозаицизма по всем хромосомам колеблется от 0 до 14%. Методом FISH исследователи выявляли более высокую частоту мозаичных форм кариотипа спонтанных абортусов, в одной работе мозаицизм составил 37% [9], в другой – 50,3% [18]. Сравнивая полученные нами данные с приведенными в литературе, мы склонны рассматривать выявленный мозаицизм характерным именно для этиологии неразвивающейся беременности.

Учитывая, что частота хромосомных аномалий среди эмбрионов при неразвивающейся беременности выше, чем при самопроизвольных абортах [7, 9, 16], есть основание полагать, что гибель эмбриона при несостоявшемся аборте чаще вызвана генетическими факторами, чем при беременности, завершившейся самопроизвольным абортом. Это ставит новые вопросы о возможных механизмах внутри­утробной задержки погибшего эмбриона при несостоявшемся аборте и причинах гибели плода с нормальной хромосомной конституцией.

Анализ результатов патоморфологического исследования продуктов зачатия в условиях беременности, осуществленный в соответствии с разработанной схемой, показал, что при сроке остановки развития плодов 4-11,5 (7,5±1,8) нед в материале хориона обнаруживались эмбриональные ворсины разной степени зрелости с преобладанием незрелых ворсин промежуточного типа. Ворсины с единичными тонкостенными сосудами составили 25%, без сосудов – 63%. Лишь в отдельных случаях (12%) сосуды в ворсинах хориона были сформированы полностью в соответствии со сроком гестации (табл. 2).

Оценивая характер формирования маточно-плацентарной области с позиций выраженности гравидарной трансформации децидуальной ткани, мы определяли степень инвазии цитотрофобласта. В препаратах соскобов эндометрия преобладали клетки децидуальной ткани с элементами цитолиза, что сопровождалось слабой (43%) или умеренной (30%) инвазией трофобласта (пролиферацией эпителия хориона) с резким отставанием (42%) и отсутствием (11%) гравидарной перестройки спиральных артерий (табл. 3).

В табл. 3 отражены также результаты анализа признаков воспалительного процесса в тканях соскоба из полости матки. В 14% случаев выявлена очаговая воспалительная инфильтрация. Наличие в составе инфильтрата лимфогистиоцитарных элементов указывает на присутствие еще в прегравидарный период воспалительного процесса в эндометрии, на фоне которого наступила беременность. Это послужило одной из причин нарушения имплантации плодного яйца и регресса данной беременности. В 26% случаев наблюдались рассеянные лимфоцитарные инфильтраты с нейтрофильными элементами. Смешанный характер инфильтрации может свидетельствовать о присоединении острого воспалительного процесса во время беременности к уже существовавшему ранее. Наличие в биоптатах в 39% случаев рассеянной лимфогистиоцитарной инфильтрации как в децидуальной ткани, так и в ворсинах хориона, указывает на имевшие место причины воспалительного генеза, обусловившие сочетанные нарушения имплантации и инвазии трофобласта. Во всех случаях рассеянная лимфоцитарная инфильтрация тканей биоптата из полости матки расценивалась как признак активации иммунных реакций со стороны децидуальной ткани, направленных на отторжение плодного яйца [1, 19].

Для оценки суммарных взаимодействий компонентов системы мать-плацента-плод при неразвивающейся беременности и их влияния на гибель плода был проведен анализ следующих морфологических признаков: выраженности гравидарной трансформации сосудов эндометрия, степени развития и васкуляризации ворсин хориона, полноценности инвазии трофобласта (табл. 4).

При анализе сочетания гравидарной перестройки артерий со степенью инвазии трофобласта полноценная имплантация плодного яйца наблюдалась в 21% случаев. В 51% случаев была выявлена неполноценная инвазия трофобласта в сочетании с неполной гравидарной трансформацией сосудов эндометрия. В 23% наблюдений на фоне нормально сформированных сосудов эндометрия инвазия хориона была недостаточной. Как известно, результатом гравидарной трансформации эндометрия и инвазии трофобласта является формирование плодово-плацентарного кровообращения, которое обеспечивает газообмен и транспорт питательных веществ в системе мать-плацента-плод, что считается критическим фактором для дальнейшего роста эмбриона. В нашем исследовании плодово-плацентарное кровообращение было сформировано адекватно гестационному возрасту плода только в 21% случаев (см. табл. 4).

Анализ сочетания трех морфологических признаков, характеризующих состояние ворсин хориона – отсутствие или наличие васкуляризации, характер стромы, степень пролиферации эпителия, – с определенным кариотипом плода позволил установить следующее. Лишь один из сравниваемых морфологических признаков имел достоверную взаимосвязь с аномалиями кариотипа. Так, в 72% случаев аномальный кариотип плода сочетался с отсутствием васкуляризации ворсин хориона (р=0,05; ОШ=2,72; 95% ДИ: 1-7,36) (табл. 5). Иными словами, риск полного отсутствия васкуляризации ворсин хориона на фоне хромосомной аномалии у плода в 2,7 раза выше, чем при нормальном кариотипе плода при неразвивающейся беременности.

По данным табл. 6, полное или частичное нарушение васкуляризации ворсин хориона обнаружено в 87% случаев, среди которых 54% были ассоциированы с аномальным кариотипом плода, 33% – с нормальным кариотипом. Среди плодов с нормальным кариотипом васкуляризация ворсин хориона была выраженной только у 13%. С одинаковой частотой встречалось полное отсутствие васкуляризации ворсин хориона (48%) или разная степень формирования сосудов ворсин (39%) (см. табл. 5). Можно заключить, что формирование сосудов хориона зависит от многих факторов ангиогенеза и определяется не только аномалиями кариотипа плода.

Проведенные нами исследования подтверждают сложившееся мнение о том, что патоморфологические изменения формирующейся плаценты имеют неспецифический характер при различных хромосомных аномалиях и отражают общие нарушения ее развития. В то же время полученные нами данные по морфологическим особенностям сосудов хориона при хромосомном дисбалансе могут представлять интерес в плане как одного из критериев диагностики, так и изучения типовых общепатологических процессов, приводящих к нарушениям в эмбриогенезе человека. Это особенно важно, так как в эмбриологии сегодня пока отсутствует фундаментальная теория патогенеза хромосомной патологии [2].

В ходе анализа вариантов сочетаний кариотипа плода с характером нарушений ангиогенеза плодового сосудистого русла ворсин хориона были получены следующие результаты, представленные в табл. 6.

По результатам проведенных исследований на основе комплексного анализа результатов кариотипирования плода и морфологического изучения биологического материала продуктов зачатия в 93% случаев была установлена причина неразвивающейся беременности. В 87% случаев нарушения процессов инвазии и имплантации трофобласта, следовательно, и гибель плода были обусловлены полным отсутствием или мозаичной формой васкуляризации ворсин хориона. В 6% случаев на фоне нормальной васкуляризации хориона аномальный кариотип плода послужил причиной его гибели. Только в 7% случаев причина неразвивающейся беременности осталась невыясненной, так как плод имел нормальный карио­тип и адекватно сформированное плодово-плацентарное кровообращение.

Использование в практике комплексного метода оценки результатов цитогенетического и морфологического исследований продуктов зачатия неразвивающейся беременности позволило в 93% случаев определить причину гибели плода вследствие недоразвития фетоплацентарного кровообращения и/или хромосомной аномалии плода.

Установлено, что особенностью кариотипов плодов при неразвивающейся беременности является высокая частота (19%) мозаичных форм хромосомных аномалий, что подтверждает этиологическую роль «скрытого» мозаицизма в гибели плода в I триместре беременности.

Определена достоверная взаимосвязь хромосомной аномалии плода и агенезии сосудов хориона (р=0,05; ОШ=2,72; 95% ДИ: 1-7,36), которая выявлена в 72% наблюдений аномального кариотипа. С одинаковой частотой встречалось полное отсутствие васкуляризации ворсин хориона (48%) или разная степень нарушения их васкуляризации (39%) у плодов с нормальным кариотипом. Следовательно, можно предположить, что формирование сосудов хориона обусловлено не только кариотипом плода, а зависит от многих факторов ангиогенеза.

Своевременное проведение и анализ результатов комплексного цитогенетического и морфологического исследований продуктов зачатия неразвивающейся беременности позволяет определить причину гибели плода, разработать комплекс целенаправленных мер профилактики нарушений формирования фетоплацентарного кровообращения и сформировать правильную тактику ведения будущей беременности с целью снижения перинатальных осложнений и потерь.